Люциферазы катализируют реакцию светоизлучения биолюминесцентных организмов, среди которых наиболее широко в природе распространены светящиеся бактерии. Их можно встретить как в тропических водах мирового океана, так и в северных широтах, в пресной воде и на суше. Однако бактериальные люциферазы (БЛ) принадлежат к термолабильным ферментам, инактивация которых происходит при ~37 °С [1], что затрудняет их использование в качестве репортеров или меток для молекулярного анализа in vivo, а также элементов биосенсоров в полевых исследованиях. Стоит отметить, что устойчивость БЛ к термической инактивации in vitro может варьироваться в зависимости от вида бактерий, из которых был выделен фермент. Ранее на основании филогенетического анализа было показано, что данные белки можно разделить на две высоко гомологичные группы [2]. Более того, к одной из групп относятся БЛ с быстрой кинетикой биолюминесцентной реакции, к другой – с медленной. Для некоторых «медленных» люцифераз ранее была обнаружена более высокая термостабильность, среди «быстрых» же чаще можно обнаружить психрофильные ферменты. Таким образом, изучение влияния различных температур на активность и структуру БЛ с различными типами кинетики представляет собой актуальную задачу с точки зрения их применения в аналитических методах.

Целью исследования было установить зависимость от температуры кинетических и структурных характеристик двух типов бактериальных люцифераз: «медленной» Vibrio harveyi и «быстрой» Photobacterium leiognathi. Помимо этого, было исследовано влияние на температурные зависимости бактериальных люцифераз природного экстремолита сахарозы.

Экспериментально были изучены следующие характеристики БЛ двух типов при различных температурах: (1) активность, (2) скорость термоинактивации и (3) денатурация, индуцированная нагреванием. Кинетику реакции люцифераз V. harveyi и P. leiognathi (ООО «Биолюмдиагностика») при температуре 5-45 °С измеряли методом остановленного потока на анализаторе SX-20 (Applied Photophysics). Компоненты реакции инкубировали при заданной температуре в течение 5 мин перед измерением кинетики. Скорость термоинактивации ферментов оценивали путем измерения их остаточной активности (при 20°С) после инкубации в течение различного времени при необходимой температуре в диапазоне 40–55 °С. Для инкубации ферментов использовали твердотельный термостат Гном (ДНК-Технология). Калориметрические измерения проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре SCAL-1 (Scal Co. Ltd.) при скорости сканирования 1 град/мин и давлении 2,5 атм. Кроме того, было проведено по три запуска моделирования молекулярной динамики (МД) обоих ферментов в течение 100 нс при температурах 5, 10, 27, 45, 60 °C с использованием программного пакета GROMACS 2020.4.

Анализ кинетики реакции при 5–45 °C выявил различную чувствительность двух люцифераз к температуре раствора. В частности, при каждом изменении температуры на 5 °C наблюдалось выраженное изменение активности люциферазы P. leiognathi, тогда как активность люциферазы V. harveyi оставалась постоянной в диапазоне температур 20–35 °C. Результаты МД показали, что более высокая активность люциферазы P. leiognathi при низких температурах может достигаться за счет особенностей динамики мобильной петли, формирующей активный центр. Структура люциферазы V. harveyi оказалась более стабильна при 60 °C, о чем свидетельствует меньшее стандартное отклонение параметра RMSD за время моделирования. Наблюдаемая термолабильность люциферазы P. leiognathi и ее более высокая активность в оптимальных условиях (при 20–25 °C) по сравнению с люциферазой V. harveyi согласуются с представлениями о структурно-функциональных особенностях холодоадаптированных белков.

Помимо активности, была изучена структурная стабильность белков, которая играет важную роль в поддержании их функции при изменении температуры. Было установлено, что в одних и тех же условиях скорость термоинактивации люциферазы V. harveyi всегда меньше, чем фермента P. leiognathi. Сахароза замедляет термоинактивацию ферментов в 2–4 раза, но без существенного снижения энергии активации процесса, которая в буфере и сахарозе составила для люциферазы V. harveyi 237 ± 30 кДж/моль и 224 ± 7 кДж/моль, а для фермента P. leiognathi 255 ± 27 и 243 ± 47 кДж/моль, соответственно. Наблюдаемый эффект сахарозы может быть связан с уменьшением колебаний мобильной петли при высоких температурах, которое наблюдалось в ходе МД. Исследование денатурации БЛ с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии показало, что температура плавления люциферазы V. harveyi выше, чем фермента P. leiognathi (47,0 и 45,4 °C соответственно). В присутствии сахарозы температура плавления обоих ферментов увеличивается до 50,1 и 52,0 °C для P. leiognathi и V. harveyi соответственно. Таким образом, оба подхода показали, что люцифераза V. harveyi обладает более высокой температурной стабильностью, чем P. leiognathi, и сахароза способна защищать белки от температурной инактивации и денатурации.

Литература:

1. Zavilgelsky G. B. et al. Role of Hsp70 (DnaK–DnaJ–GrpE) and Hsp100 (ClpA and ClpB) chaperones in refolding and increased thermal stability of bacterial luciferases in Escherichia coli cells //Biochemistry (Moscow). – 2002. – Т. 67. – №. 9. – С. 986-992.

2. Deeva A. A. et al. Structure-Function Relationships in Temperature Effects on Bacterial Luciferases: Nothing Is Perfect //International Journal of Molecular Sciences. – 2022. – Т. 23. – №. 15. – 8119.

Luciferases are responsible for light emitting reactions in luminous organisms, among which bacteria are the most widespread in nature. They can be isolated both from the tropical waters of the global ocean, and in northern latitudes, in fresh water and on land. However, bacterial luciferases (BLs) belong to thermolabile enzymes, which undergo inactivation at ~37°C [1]. This makes it difficult to implement them as reporters or labels for in vivo molecular analysis, as well as biosensor elements in field studies.The stability of BL to thermal inactivation in vitro could vary depending on the bacterial species from which it was isolated. A recent phylogenetic analysis of BL amino acid sequences showed that they fall into two highly homologous groups [2]. Each group comprises BLs with the similar type of decay kinetics: “fast” or “slow”. Several "slow" luciferases are characterised by relatively high thermal stability, while among the "fast" luciferases, psychrophilic enzymes can be found more often. Thus, the study of the influence of different temperatures on the activity and structure of BLs with different types of kinetics is a topical issue considering their application in analytical methods.

This research aimed to reveal the effect of temperature on the reaction kinetics and structure of two types of bacterial luciferases: "slow" Vibrio harveyi and "fast" Photobacterium leiognathi. In addition, the role of natural extremolite (sucrose) in maintaining the activity of these enzymes under unfavorable temperature conditions was studied.

The following characteristics of two types of BLs were experimentally studied at different temperatures: (1) activity, (2) the rate of thermal inactivation, and (3) heat-induced denaturation. The reaction kinetics of V. harveyi and P. leiognathi luciferases (OOO Biolumdiagnostics) at a temperature of 5–45 °C was measured by the stopped flow method on an SX-20 analyzer (Applied Photophysics). The reaction components were incubated at a given temperature for 5 min before measuring the kinetics. The thermal inactivation rate of the luciferases was estimated by measuring the remaining activity of the enzymes (at 20 °C) after their incubation for various times under the required temperature in the range 40–55 °C. Solid-state thermostat Gnom (DNA technology) was used for enzyme incubation. Calorimetric measurements were made using a precision scanning microcalorimeter SCAL-1 (Scal Co. Ltd.) at a scanning rate of 1 K/min and under 2.5 atm pressure. In addition, three 100-ns runs of molecular dynamics (MD) simulations were performed for both enzymes at 5, 10, 27, 45, and 60 °C using the GROMACS 2020.4 software package.

The study of reaction kinetics at 5–45 °C revealed the different sensitivity of two luciferases to the temperature of solution. In particular, P. leiognathi luciferase responds by the pronounced activity change for each temperature shift of 5 ◦C, while V. harveyi luciferase provides about the same peak intensity within a wide range of 20–35 °C. The results of MD showed that a higher activity of P. leiognathi luciferase at low temperatures can be due to the peculiarities of the mobile loop dynamics, which forms the active center. The structure of V. harveyi luciferase was more stable at 60°C, as evidenced by the lower standard deviation of the RMSD parameter during the simulation. The observed thermal lability of P. leiognathi luciferase and its higher activity under optimal conditions (at 20–25°C) as compared to V. harveyi luciferase are consistent with the idea of the structural and functional features of cold-adapted proteins.

In addition to activity, the structural stability of proteins, which plays an important role in maintaining their function under temperature changes, was studied. It was found that under the same conditions, the rate of thermal inactivation of V. harveyi luciferase is always lower than that of P. leiognathi enzyme. Sucrose slows down the thermal inactivation of the enzymes by a factor of two to four times, but without a significant reduction in the activation energy of the process, which in buffer and sucrose solution was 237 ± 30 and 224 ± 7 kJ/mol for V. harveyi luciferase, and 255 ± 27 and 243 ± 47 kJ/mol for P. leiognathi enzyme, respectively. The revealed effect of sucrose may be associated with a decrease in mobile loop oscillations at high temperatures, which was observed during MD. The study of denaturation of BLs using differential scanning calorimetry showed that the melting temperature of V. harveyi luciferase is higher than that of P. leiognathi enzyme (47.0 and 45.4 °C, respectively). In the presence of sucrose, the melting point of both enzymes increases to 50.1 and 52.0 °C for P. leiognathi and V. harveyi, respectively. Thus, both approaches showed that V. harveyi luciferase is more thermostable than P. leiognathi, and sucrose is able to protect proteins from thermal inactivation and denaturation.

Literature:

1. Zavilgelsky G. B. et al. Role of Hsp70 (DnaK–DnaJ–GrpE) and Hsp100 (ClpA and ClpB) chaperones in refolding and increased thermal stability of bacterial luciferases in Escherichia coli cells //Biochemistry (Moscow). – 2002. – Vol. 67. – №. 9. – P. 986-992.

2. Deeva A. A. et al. Structure-Function Relationships in Temperature Effects on Bacterial Luciferases: Nothing Is Perfect //International Journal of Molecular Sciences. – 2022. – Vol. 23. – №. 15. – 8119.