В этом исследовании мною были использованы методы молекулярного моделирования, чтобы изучить все возможные структуры контактов между (G3T)nG3/(C3A)nC3-содержащими дуплексами с учетом всех возможных квадруплексных (G4) и i-мотивных (IM) форм, а также вариабельности их локализации друг относительно друга, как с наличием обменов, обхватов цепей, так и без них. Были рассмотрены последовательности с разным количеством повторов G/C. Для оценки изменения в структурах в процессе моделирования при тестировании их устойчивости, мною была предложена и использована система специфичных для G4/IM геометрических параметров, описывающих локализацию нуклеотидов в неканонических формах друг относительно друга. С помощью оценки основных вкладов в свободную энергию смоделированных структур в рамках подхода Обобщённого Борна были определены наиболее вероятные из них. Проведённое мною исследование позволило предположить и смоделировать значительно большое число вариантов возможных контактов посредством неканонических форм по сравнению с тем, что было предложено ранее на основании схематического подхода. Геометрия этих форм оказалась существенно сложнее и разнообразнее ранее описанных случаев неканонических структур. Моделирование позволило установить множество новых форм укладки цепей, содержащих G и/или С повторы, в неканонические структуры, которые никогда ранее не рассматривались. Опубликованные ранее гипотезы о структуре G/C-богатых ДНК-ДНК-контактов, образующихся при взаимодействии энхансер-промотор, петлеобразовании хроматина, транслокации и некоторых других этапах реорганизации хроматина, содержали лишь упрощенные модели контактов посредством переплетения цепей или укладку внешних тетрад в G4s. В большинстве случаев учитывались только G4s, хотя в ядрах живых клеток существуют как G4s, так и IMs. Кроме того, схемы опирались на доступную классификацию структур G4s, описанную для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов. Применяемый ранее схематический подход не позволял авторам отразить всё разнообразие дуплексных контактов. В частности, в данном исследовании впервые была рассмотрена возможность обмена цепями посредством образования G4/IM, а предложенные мною крестообразные структуры комплексов значительно сложнее тех, что предложил Холлидей и содержат G4s/IMs на границе центральной «дыры». Также, мною впервые была предсказана и изучена возможность формирования стопок, сформированных из право- и левозакрученных квадруплексов и слоёв, сформированных из квадруплексных сеток. Рассмотренные мною структуры позволяют предположить возможно каким образом и какие неканонические структуры формируются при обмене цепями дуплексов, содержащих G-повторы и C-повторы в процессе гомологической рекомбинации. Для реализации данного исследования была использована разработанная мною стратегия, нацеленная на создание моделей G4/IM любой сложности, которую можно использовать для in silico исследований неканонических структур ДНК и РНК. Данная стратегия включает следующие ключевые шаги. Сначала получают 3D-модели всех возможных G4 и IM для данной последовательности и объединяют их в различных ориентациях относительно друг друга с учетом возможности переплетения/блокировки нитей. Затем добавляются дуплексные фланги. Полученные модели проверяются на наличие внутренних стерических затруднений, а все геометрически невозможные отбрасываются. Затем оставшиеся структуры подвергаются МД-моделированию для проверки их устойчивости на основе вкладов в свободную энергию для определения наиболее вероятного варианта. Описанные мною структуры могут служить отправной точкой для моделирования аналогичных и, возможно, более сложных систем ДНК и РНК. Предлагаемая стратегия мною структурного in silico анализа ДНК, богатой G/C, может стать полезной альтернативой структурным исследованиям на основе РСА, криомикроскопии или ЯМР, которые редко возможны для конформационно полиморфных нуклеиновых кислот. Результаты данного исследования опубликованы в bioRxiv: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.511558

In this study, I used molecular modeling methods to investigate all possible structures of the contacts between (G3T)nG3/(C3A)nC3-containing duplexes, taking into account all possible quadruplex (G4) and i-motif (IM) forms, as well as variability of their orientation relative to each other, both with strand exchanges or mutual girths and without them. Sequences with different numbers of G/C repeats were considered. To estimate changes in the structures during modeling for testing their stability, I proposed and used a system of G4/IM-specific geometric parameters that describe the localization of nucleotides in non-canonical forms relative to each other. By scoring the main contributions to the free energy of the modeled structures within the framework of the Generalized Born approach, the most probable of them were determined. My research allowed for proposing and modeling a significantly larger number of options for contacts through non-canonical forms compared to those proposed previously based on a schematic approach. The geometry of these forms turned out to be much more complicated and diverse than the previously described cases of non-canonical structures. Modeling allowed me to establish many new ways of folding of chains containing G and/or C repeats into non-canonical structures that have never been considered before. Previously published hypotheses about the structure of G/C-rich DNA-DNA contacts formed during enhancer-promoter interactions, chromatin loop formation, translocation, and some other stages of chromatin reorganization contained only simplified models of contacts by means of strand entanglement or stacking of outer tetrads in G4s. In most cases, only G4s were considered, although both G4s and IMs exist in the nuclei of living cells. In addition, the schemes relied on the available classification of G4 structures described for short single-stranded oligonucleotides. The previously used schematic approach did not allow the authors to reflect the whole diversity of duplex contacts. In particular, in this study, the possibility of chain exchange through the formation of G4/IM was considered for the first time, and the cross-shaped junctions s of the complexes proposed by me are much more complicated than those proposed by Holliday and contain G4s/IMs at the boundary of the central “hole”. Also, for the first time, I predicted and studied the possibility of stacks formed from right- and left-handed quadruplexes, and layers formed from quadruplex grids. The structures have considered me make it possible to suggest what kind of non-canonical structures are formed during the exchange of chains of duplexes containing G-repeats and C-repeats in the process of homologous recombination. To implement this study, I developed a strategy for creating G4 / IM models of any complexity, which can be used for in silico studies of non-canonical DNA and RNA structures. This strategy includes the following key steps. First, 3D models of all possible G4s and IMs for a given sequence are obtained and combined in various orientations relative to each other, taking into account the possibility exchanging and girthing of strands. Then, the duplex flanks are added. The resulting models are checked for the presence of internal steric hindrances, and all geometrically impossible ones are discarded. The remaining structures are then subjected to MD simulation to test their stability based on free energy contributions to determine the most probably variant. The structures I have described can serve as a starting point for modeling similar and possibly more complex DNA and RNA systems. The proposed strategy for the structural in silico analysis of G/C-rich DNA can be a useful alternative to structural studies based on X-ray diffraction, cryomicroscopy or NMR, which are rarely applicable to conformationally polymorphic nucleic acids. The results of this study have been published in bioRxiv: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.511558