SAA представляет собой α-спиральный белок, одна из функций которого - участие в иммунном ответе. При хронических воспалительных заболеваниях концентрация SAA в крови повышается, что приводит к его агрегации и формированию амилоидов в различных органах и тканях. К настоящему времени эффективные методы лечения SAA амилоидоза отсутствуют, и терапия направлена лишь на купирование симптомов. В связи с этим исследование амилоидной агрегации данного белка является важным направлением молекулярной биофизики и медицины.

В тканях пациентов с SAA-амилоидозом обнаруживаются фибриллы, состоящие из фрагментов белка. Поэтому к настоящему времени нет ответа на вопрос о том, формирует ли полноразмерный SAA амилоиды, либо перед агрегацией он подвергается протеолизу. Недостаток информации связан с тем, что в большинстве работ исследования амилоидообразования SAA проводили на модели белка мыши, либо белка человека, содержащего вследствие экспрессии в бактериальных клетках добавочный метионин на N-конце. Такие белки характеризовались пониженной амилоидогенностью или ее отсутствием. В отличие от этого в данной работе впервые была получена генетическая конструкция для экспрессии SAA человека в убиквитиновой системе, что позволило очистить полноразмерный белок без добавочных аминокислотных остатков.

Данные по перешивке белка глутаровым альдегидом, свидетельствуют о том, что SAA при рН 8,3 присутствует в растворе в виде мономера. Через 6 часов инкубации при температуре 37°С белок формирует агрегаты, которые, согласно результатам электронной микроскопии, представляют собой фибриллы длиной до 150 нм. Анализ спектров кругового дихроизма в дальней УФ области свидетельствуют об изменении вторичной структуры агрегатов по сравнению с мономером и уменьшении в них процентного содержания α-спиралей. Полученные фибриллы связывают флуоресцентный краситель тиофлавин Т, специфический для амилоидной кросс-β-структуры. Таким образом, совокупность полученных результатов, позволяет сделать вывод, что в выбранных условиях SAA формирует амилоиды.

Для определения фрагментов белка, участвующих в формировании межмолекулярных взаимодействий в амилоидах был проведен ограниченный протеолиз мономерного белка и фибрилл с помощью неспецифической протеиназы К. Показано, что в условиях, при которых наблюдается полное расщепление мономерного белка, длина фрагментов, устойчивых к протеолизу в амилоидах соответствуют полноразмерному SAA. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что вся полипептидная цепь SAA участвует в формировании межмолекулярных взаимодействия в амилоидах. Результаты данной работы позволяют получить новую информацию об особенностях формирования амилоидов SAA и указывают на необходимость использования полноразмерного белка для дальнейших исследований его агрегации, а также поиска подходов к ее ингибированию.

SAA is an α-helical protein, one of its functions is immune response. In chronic inflammatory diseases, the concentration of SAA in the blood increases, leading to its aggregation and the amyloids formation in various organs and tissues. To date, there are no effective treatments for SAA amyloidosis, and therapy is aimed only at relieving symptoms. Therefore, the study of amyloid aggregation of this protein is an important direction in molecular biophysics and medicine.

Fibrils consisting of protein fragments are found in the tissues of patients with SAA-amyloidosis. Therefore, to date, there is no answer to the question of whether the full-length SAA forms amyloids, or before aggregation it undergoes proteolysis. The lack of information is because of in most studies, investigation of SAA amyloid formation was carried out on a model of a mouse protein or a human protein with additional methionine at the N-terminus due to expression in bacterial cells. These proteins were characterized by reduces amyloidogenicity or its absence. In contrast, in this work, for the first time, a genetic construct for the expression of SAA in the ubiquitin system was obtained, allowing the purification of the full-length protein without additional amino acid residues.

Data on protein crosslinking with glutaraldehyde indicate that SAA at pH 8.3 is present in solution as a monomer. After 6 hours of incubation at a temperature of 37°C, the protein forms aggregates, which, according to electron microscopy, are fibrils to 150 nm long. Analysis of the circular dichroism spectra in the fat UV region indicates a change in the secondary structure of the aggregates compared to the monomer and decrease in α-helices content in them. The resulting fibrils bind the fluorescence dye thioflavin T, which is specific for the amyloid cross-β-structure. Thus, the results obtained conclude that under chosen conditions SAA forms amyloids.

To determine the protein fragments involved in the formation of intermolecular interactions in amyloids, limited proteolysis of the monomeric protein and fibrils was carried out using nonspecific proteinase K. It was shown that under conditions where complete cleavage of the monomeric protein is observed, the length of fragments resistant to proteolysis is amyloids correspond to full-length SAA. These data conclude that the SAA full-chain is involved in the formation of intermolecular interactions in amyloids. The results of this work provide new information about the formation of SAA amyloids and indicate the need to use a full-length protein for further studies of its aggregation, as well as the search for approaches to its inhibition.