VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Молекулярная биофизика. Структура и динамика биополимеров и биомакромолекулярных систем

Исследование воздействия кураксина CBL0137 на структуру нуклеосом методом spFRET-TIRF-микроскопии

О.В. Гераськина1, Н.В. Малюченко1*, Н.С. Герасимова1, А.В. Любителев1, А.В. Феофанов1, В.М. Студитский2

1.МГУ, биологический факультет;
2.Программа эпигенетики рака, Центр исследований рака Фокс Чейз, Филадельфия;

* mal_nat(at)mail.ru

Кураксин CBL0137 принадлежит к группе ДНК-тропных противоопухолевых препаратов. Связываясь, кураксин затрудняет взаимодействие ряда ферментов, таких как топоизомеразы и ДНК-метилтрансферазы, и гистонов с ДНК, а также способствуют захвату в хроматине мультисубъединичного белкового комплекса FACT [1]. В клетке кураксин воздействует на множественные сигнальные пути, активируя р53 и подавляя активность факторов NF-κB, HSF1 [2]. Молекулярные механизмы действия CBL0137 на хроматин и, в частности, на его структурную единицу - нуклеосому являются предметом активного изучения. Для исследований in vitro нуклеосомы могут быть собраны на основе коровых гистонов и матричной ДНК, содержащей высокоаффинную нуклеосом-позиционирующую последовательность. Мононуклеосомы позволяют изучать отдельные аспекты сложных процессов, происходящих в хроматине с участием гистоновых шаперонов, хроматиновых ремоделеров и факторов транскрипции [3-5]. Ранее нами было обнаружено, что кураксин CBL0137 вызывает концентрационно-зависимые изменения структуры нуклеосом [6]. В настоящей работе структурные изменения и конформационные переходы, происходящие в нуклеосомах под действием кураксина, были исследованы с помощью флуоресцентной микроскопии одиночных частиц на основе эффектов полного внутреннего отражения и Фёрстеровского резонансного переноса энергии (spFRET-TIRF-микроскопии).

Для проведения экспериментов методом TIRF-микроскопии использовали иммобилизованные нуклеосомы. Были сконструированы флуоресцентно-меченые мононуклеосомы с линкерным участком ДНК, биотинилированным по 5’-концу. Матричную ДНК с введённой FRET-парой меток Cy3/Cy5 и сайтом рестрикции TspRI в концевой области синтезировали с помощью ПЦР. Метки располагали таким образом, чтобы после сборки нуклеосом они располагались на соседних супервитках ДНК на расстоянии друг от друга меньше радиуса Фёрстера. Сборку нуклеосом выполняли, как описано ранее [7]. Нуклеосомы лигировали с биотинилированным фрагментом ДНК, содержавшим сайт рестрикции TspRI. Биотинилированные нуклеосомы иммобилизовали на стекле, модифицированном биотинилированным полиэтиленгликоль-силаном и стрептавидином [8]. Концентрацию нуклеосом подбирали так, чтобы после иммобилизации они располагались на расстоянии больше нескольких микрон друг от друга. Измерения выполняли с использованием экспериментальной установки на основе инвертированного флуоресцентного микроскопа с лазерным модулем и адаптором для TIRF-микроскопии, как описано ранее [8]. По серии изображений, полученных с временным разрешением 300-500 мс, анализировали динамику величины FRET для отдельных нуклеосом и распределение усредненных по времени значений этой величины в популяции частиц. В условиях эксперимента ~ 30 % иммобилизованных нуклеосом сохраняли нативную структуру с уровнем FRET 0.5 – 0.7. При концентрации кураксина 5 мкМ в нуклеосомах обнаружены значительные стохастические изменения эффективности FRET, указывающие на ослабление взаимодействий между нуклеосомной ДНК и коровыми гистонами и образование неустойчивых конформационных состояний, находящихся в динамическом равновесии. При концентрации кураксина 10 мкМ в нуклеосомах происходило уменьшение эффективности FRET до нуля, что указывает на расхождение соседних супервитков нуклеосомной ДНК на расстояние больше 10 нм. При этом обратных конформационных переходов, приводящих к сближению супервитков, на отрезке времени в несколько десятков секунд не обнаружено. После удаления свободного кураксина из раствора восстановления исходной структуры в большинстве нуклеосом не происходит в течение не менее десяти минут, что свидетельствует либо о медленной кинетике диссоциации кураксина из комплекса с ДНК, либо о необратимой диссоциации самих нуклеосом на коровые гистоны и ДНК-матрицу.

Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 21-74-20018). В исследованиях использовали оборудование ЦКП ИБХ 2020.



1. Chang HW, Valieva ME, Safina A, Chereji RV, Wang J, Kulaeva OI, Kirpichnikov MP, Feofanov AV, Gurova KV, Studitsky VM. Mechanism of FACT removal from transcribed genes by anticancer drugs curaxins. Sci Adv. 2018 Nov 7;4(11):eaav2131. doi: 10.1126/sciadv.aav2131

2. Maluchenko NV, Chang HW, Kozinova MT, Valieva ME, Gerasimova NS, Kitashov AV, Kirpichnikov MP, Studitsky VM. Inhibiting the pro-tumor and transcription factor FACT: Mechanisms. Mol Biol (Mosk). 2016 50(4):599-610. Russian. doi: 10.7868/S002689841604008X

3. Kotova EY, Hsieh FK, Chang HW, Maluchenko NV, Langelier MF, Pascal JM, Luse DS, Feofanov AV, Studitsky VM. Human PARP1 Facilitates Transcription through a Nucleosome and Histone Displacement by Pol II In Vitro. Int J Mol Sci. 2022 ;23(13):7107. doi: 10.3390/ijms23137107

4. Malinina DK, Sivkina AL, Korovina AN, McCullough LL, Formosa T, Kirpichnikov MP, Studitsky VM, Feofanov AV. Hmo1 Protein Affects the Nucleosome Structure and Supports the Nucleosome Reorganization Activity of Yeast FACT. Cells. 2022;11(19):2931. doi: 10.3390/cells11192931

5. Chang HW, Feofanov AV, Lyubitelev AV, Armeev GA, Kotova EY, Hsieh FK, Kirpichnikov MP, Shaytan AK, Studitsky VM. N-Terminal Tails of Histones H2A and H2B Differentially Affect Transcription by RNA Polymerase II In Vitro. Cells. 2022;11(16):2475. doi: 10.3390/cells11162475

6. Gaykalova DA, Kulaeva OI, Bondarenko VA, Studitsky VM. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes. Methods Mol Biol. 2009;523:109-23. doi: 10.1007/978-1-59745-190-1_8.

7. Volokh OI, Sivkina AL, Moiseenko AV, Popinako AV, Karlova MG, Valieva ME, Kotova EY, Kirpichnikov MP, Formosa T, Studitsky VM, Sokolova OS. Mechanism of curaxin-dependent nucleosome unfolding by FACT. Front Mol Biosci. 2022;9:1048117. doi: 10.3389/fmolb.2022.1048117

8. Kudryashova KS, Chertkov OV, Ivanov YO, Studitskiy VM, Feofanov AV (2016). Experimental setup for the study of immobilized single nucleosomes using total internal reflection fluorescence. Moscow Univ Biol Sci Bull 71 (2), 97–101 10.3103/S0096392516020048

Study of the effect of curaxin CBL0137 on the structure of nucleosomes using spFRET-TIRF microscopy

O.V. Geraskina1, N.V. Maluchenko1*, N.S. Gerasimova1, A.V. Lyubitelev1, A.V. Feofanov1, V.M. Studitsky2

1.Biological faculty of Lomonosov Moscow state university;
2.Cancer Epigenetics Program, Fox Chase Cancer Research Center, Philadelphia;

* mal_nat(at)mail.ru

Curaxin CBL0137 belongs to the group of DNA-binding anticancer drugs. By binding, curaxin interferes the interaction of a number of enzymes, such as topoisomerases and DNA methyltransferases, and histones with DNA, and also promotes the capture of the FACT multisubunit protein complex in chromatin [1]. In the cell, curaxin acts on multiple signaling pathways, activating p53 and suppressing the activity of NF-κB and HSF1 factors [2]. The molecular mechanisms of the action of CBL0137 on chromatin and, in particular, on its structural unit, the nucleosome, are the subject of active study. For in vitro studies, nucleosomes can be assembled using core histones and template DNA containing a high affinity nucleosome positioning sequence. Mononucleosomes make it possible to study certain aspects of complex processes occurring in chromatin with the participation of histone chaperones, chromatin remodelers, and transcription factors [3–5]. Previously, we found that curaxin CBL0137 causes concentration-dependent changes in the structure of nucleosomes. [6]. In this work, structural changes and conformational transitions occurring in nucleosomes under the action of curaxin were studied using single particle fluorescence microscopy based on total internal reflection effects and Förster resonance energy transfer (spFRET-TIRF microscopy).

Immobilized nucleosomes were used to carry out experiments by TIRF microscopy. Fluorescently labeled mononucleosomes were constructed with the DNA linker region biotinylated at the 5' end. Template DNA with the introduced Cy3/Cy5 FRET pair of labels and a TspRI restriction site in the terminal region was synthesized by PCR. The labels were positioned in such a way that, after the assembly of nucleosomes, they were located on adjacent DNA supercoils at a distance from each other less than the Förster radius. Nucleosome assembly was performed as described previously [7]. Nucleosomes were ligated to a biotinylated DNA fragment containing a TspRI restriction site. Biotinylated nucleosomes were immobilized on glass modified with biotinylated polyethylene glycol silane and streptavidin [8]. The concentration of nucleosomes was chosen so that after immobilization they were located at a distance of more than a few microns from each other. Measurements were performed using an experimental setup based on an inverted fluorescence microscope with a laser module and an adapter for TIRF microscopy, as described previously [8]. Based on a series of images obtained with a time resolution of 300–500 ms, we analyzed the dynamics of the FRET value for individual nucleosomes and the distribution of time-averaged values of this value in the population of particles. Under experimental conditions, ~30% of immobilized nucleosomes retained their native structure with a FRET level of 0.5–0.7. At a curaxin concentration of 5 μM in nucleosomes, significant stochastic changes in FRET efficiency were found, indicating a weakening of interactions between nucleosomal DNA and core histones and the formation of unstable conformational states in dynamic equilibrium. At a curaxin concentration of 10 μM in nucleosomes, the FRET efficiency decreased to zero, which indicates the separation of adjacent supercoils of nucleosomal DNA over a distance of more than 10 nm. In this case, no reverse conformational transitions leading to the convergence of supercoils were found in a time interval of several tens of seconds. After the removal of free curaxin from the solution, the initial structure is not restored in most nucleosomes for at least ten minutes, which indicates either a slow dissociation kinetics of curaxin from the complex with DNA or an irreversible dissociation of the nucleosomes themselves into core histones and a DNA template.

Financing. The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation (project no. 21-74-20018). In the studies, the equipment of the TsKP IBCh 2020 was used.

1. Chang H, Valieva M, Safina A, Chereji R, Wang J, Kulaeva O, Morozov A, Kirpichnikov M, Feofanov A, Gurova K, Studitsky V. Mechanism of FACT removal from transcribed genes by anticancer drugs curaxins. Sci Adv. 2018 Nov 7;4(11):eaav2131. doi: 10.1126/sciadv.aav2131

2. Maluchenko N, Chang H, Kozinova M, Valieva M, Gerasimova N, Kitashov A, Kirpichnikov M, Studitsky V. Inhibiting the pro-tumor and transcription factor FACT: Mechanisms. Mol Biol (Mosk). 2016 50(4):599-610. Russian. doi: 10.7868/S002689841604008X

3. Kotova E, Hsieh F, Chang H, Maluchenko N, Langelier M, Pascal J, Luse D, Feofanov A, Studitsky V. Human PARP1 Facilitates Transcription through a Nucleosome and Histone Displacement by Pol II In Vitro. Int J Mol Sci. 2022 ;23(13):7107. doi: 10.3390/ijms23137107

4. Malinina D, Sivkina A, Korovina A, McCullough L, Formosa T, Kirpichnikov M, Studitsky V, Feofanov A. Hmo1 Protein Affects the Nucleosome Structure and Supports the Nucleosome Reorganization Activity of Yeast FACT. Cells. 2022;11(19):2931. doi: 10.3390/cells11192931

5. Chang H, Feofanov A, Lyubitelev A, Armeev G, Kotova E, , Kirpichnikov M, Shaytan A, Studitsky V. N-Terminal Tails of Histones H2A and H2B Differentially Affect Transcription by RNA Polymerase II In Vitro. Cells. 2022;11(16):2475. doi: 10.3390/cells11162475

6. Gaykalova D, Kulaeva O, Bondarenko V, Studitsky V. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes. Methods Mol Biol. 2009;523:109-23. doi: 10.1007/978-1-59745-190-1_8.

7. Volokh O, Sivkina A, Moiseenko A, Popinako A, Karlova M, Valieva M, Kotova E, Kirpichnikov M, Formosa T, Studitsky V, Sokolova O. Mechanism of curaxin-dependent nucleosome unfolding by FACT. Front Mol Biosci. 2022;9:1048117. doi: 10.3389/fmolb.2022.1048117

8. Kudryashova K, Chertkov O, Ivanov Y, Studitskiy V, Feofanov A (2016). Experimental setup for the study of immobilized single nucleosomes using total internal reflection fluorescence. Moscow Univ Biol Sci Bull 71 (2), 97–101, 10.3103/S0096392516020048



Докладчик: Малюченко Н.В.
132
2023-01-10

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists