Исследование гидратации ДНК ведётся давно с использованием множества экспериментальных и теоретических подходов. Их абсолютное большинство направлено на изучение гидратных структур, включающих 10-20 молекул воды (на нуклеотид) с сильно изменённой энергией. В этом диапазоне гидратных чисел реализуются фундаментальные переходы ДНК между конформациями В↔А, В↔Z [1]. Даже если молекулы ДНК пребывают в нативном состоянии, при столь небольшой гидратации нельзя быть уверенным в «нативном» состоянии их гидратных оболочек, какими они являются в живой природе. Поэтому необходимо также изучать гидратацию ДНК в системах с бо́льшим содержанием воды, то есть в разбавленных водных растворах.

Одним из информативных методов исследования гидратации в растворах является диэлектрическая спектроскопия, позволяющая определять спектры комплексной диэлектрической проницаемости (КДП). Особой разновидностью диэлектрической спектроскопии является терагерцовая спектроскопия временного разрешения (THz-TDS). Терагерцовый диапазон лежит между гигагерцовой областью, где проявляется коллективная динамика молекул вещества, и инфракрасной областью, отражающей внутримолекулярные колебания небольших молекулярных групп. Терагерцовый диапазон по энергиям и частотам как раз соответствует межмолекулярной структуре и динамике воды, поэтому несёт богатую информацию о гидратации.

В настоящей работе предложен подход на основе THz-TDS для исследования гидратации ДНК, суть которого заключается в следующем. Измеряются спектры КДП раствора ДНК, чистого растворителя (аналогичный водный раствор без ДНК) и сухого образца ДНК в диапазоне 10-110 〖см〗^(-1). Из спектров КДП раствора ДНК исключается диэлектрический вклад молекул ДНК с помощью разработанной нами модели эффективной среды для двухфазных диэлектриков с нитевидными включениями [2]. Это позволяет получить спектры КДП водной фазы раствора ДНК. Спектры КДП водной фазы раствора ДНК и растворителя подвергаются процедуре фитинга, согласно модельной КДП, учитывающей три основные, хорошо известные, области дисперсии воды в терагерцовом диапазоне:

ε^*=(Δε_1)/(1-iωτ_1 )+(Δε_2)/(1-iωτ_2 )+A/(ω_0^2-ω^2-iωγ)+ε_∞+i σ_0/(ε_0 ω), (1)

где τ_1 и Δε_1 – время и амплитуда релаксации связанных молекул воды (Дебаевской релаксации); τ_2 и Δε_2 – время и амплитуда ориентационной релаксации свободных молекул воды; A, ω_0, γ – амплитуда, резонансная частота и параметр затухания межмолекулярных продольных колебаний молекул воды, связанных водородными связями; ε_∞ – высокочастотная диэлектрическая проницаемость, σ_0 – проводимость в постоянном поле, ε_0 – диэлектрическая постоянная, ω – циклическая частота, i – мнимая единица. Рассчитанные на основе фитинга параметры водной фазы раствора ДНК и растворителя сравнивались друг с другом на предмет выявления отличий. Поскольку водная фаза раствора ДНК отличается от водной фазы растворителя наличием гидратных оболочек ДНК, то из сравнения значений их параметров можно извлекать информацию о гидратных оболочках. При этом все параметры обладают определённым физическим смыслом в терминах межмолекулярной структуры и динамики воды, установленным в теории диэлектрической спектроскопии.

Описанным способом анализировалась гидратация ДНК в трёх растворителях: вода, водные растворы 40 мМ MgCl_2 и 150 мМ KCl. Использовались растворы плазмидной ДНК pET-11c в кольцевой форме с концентрацией 25 мг/мл. Кольцевая форма предпочтительна (по сравнению с суперскрученной), поскольку у неё достигается максимальная площадь контакта поверхности ДНК с водой, что максимизирует наблюдаемые эффекты гидратации.

Для всех рассмотренных растворов ДНК обнаружены следующие статистически значимые отличия: уменьшение Δε_1, увеличение Δε_2 и A/ω_0^2 по сравнению с соответствующими растворителями. Уменьшение Δε_1 свидетельствует о наличии более сильно связанных молекул воды в гидратной оболочке. Как известно, такие молекулы расположены в первичной гидратной оболочке ДНК, главным образом, у фосфатов. Увеличение Δε_2 говорит об увеличении количества свободных молекул воды, по-видимому, в переходном слое между первичной гидратацией и невозмущённой водой. Увеличение A/ω_0^2 при отсутствии изменения ω_0 говорит о наличии области гидратации с увеличенным количеством водородных связей. Это, скорее всего, реализуется в желобках ДНК, поскольку там образуется значительное количество водородных связей с молекулами воды. В итоге, сделан вывод о наличии трёх различных по строению областей гидратации ДНК с указанными особенностями.

Наличие 40 мМ MgCl_2 в растворе практически не влияет на гидратацию, тогда как наличие 150 мМ KCl существенно её ослабляет, судя по всем обсуждаемым параметрам. Указанные эффекты не коррелируют с ионной силой растворов, значит, являются ион-специфичными. Ионы Mg^(2+), как известно, сильно связываются с фосфатными группами ДНК, что приводит к смене знака заряда этих групп с –1 на +1. Поэтому влияние Mg^(2+) на гидратацию ДНК по существу сводится к изменению ориентации молекул воды в слое первичной гидратации фосфатов и никак не должно влиять на остальную часть гидратной оболочки, что мы и видим по полученным результатам. Ионы K^+, напротив, не имеют сайтов сильного связывания с ДНК, значит, распределяются по всей гидратной оболочке. При этом K^+ – ион с отрицательной гидратацией, то есть оказывает разрушающее действие на структуру воды. Это объясняет обнаруженное ослабление гидратации ДНК в растворе KCl. Описанное влияние ионов K^+ с внутриклеточной концентрацией на гидратацию ДНК может иметь биологический смысл: это может быть одним из факторов влияния на функционирование ДНК через её гидратную оболочку.

Список литературы

1. Principles of nucleic acid structure: By W. Saenger. Springer-Verlag, New York. 1984.

2. N. Penkov, N. Penkova. Effective Medium Model Applied to Biopolymer Solutions. Appl. Spectrosc. (2021), 75(12): 1510-1515.

The study of DNA hydration has been conducted for a long time using a variety of experimental and theoretical approaches. The vast majority of them are aimed at studying hydrate structures, including 10-20 water molecules (per nucleotide) with a strongly changed energy. In this range of hydrate numbers, fundamental DNA transitions occur between conformations B↔A, B↔Z [1]. Even if DNA molecules are in the native state, with such a small hydration, one cannot be sure of the "native" state of their hydration shells, as they are in living nature. Therefore, it is also necessary to study DNA hydration in systems with a higher water content, that is, in dilute aqueous solutions.

One of the informative methods for studying hydration in solutions is dielectric spectroscopy, which allows determining the spectra of complex permittivity (CP). A special kind of dielectric spectroscopy is terahertz time-domain spectroscopy (THz-TDS). The terahertz range lies between the gigahertz region, where the collective dynamics of the molecules of matter is manifested, and the infrared region, reflecting the intramolecular vibrations of small molecular groups. The terahertz range (on energies and frequencies) just corresponds to the intermolecular structure and dynamics of water, therefore it carries rich information about hydration.

An approach based on THz-TDS for the study of DNA hydration is proposed, the essence of which is as follows. The CP spectra of a DNA solution, a pure solvent (a similar aqueous solution without DNA) and a dry DNA sample in the range of 10-110 см^(-1) are recorded. The dielectric contribution of DNA molecules is excluded from the CP spectra of the DNA solution using the effective medium model for two-phase dielectrics with filamentary inclusions developed by us [2]. This makes it possible to obtain CP spectra of the aqueous phase of the DNA solution. The CP spectra of the aqueous phases of the DNA solution and the solvent are subjected to the fitting procedure, according to the model CP, which takes into account three main, well-known, water dispersion regions in the terahertz range:

ε^*=(Δε_1)/(1-iωτ_1 )+(Δε_2)/(1-iωτ_2 )+A/(ω_0^2-ω^2-iωγ)+ε_∞+i σ_0/(ε_0 ω),(1)

where τ_1 and Δε_1 – relaxation time and strength of bound water molecules (Debye relaxation); τ_2 and Δε_2 – time and strength of orientation relaxation of free water molecules; A, ω_0, γ – amplitude, resonant frequency and damping parameter of intermolecular stretching vibrations of water molecules bound by hydrogen bonds; ε_∞ – high-frequency permittivity, σ_0 – dc-conductivity, ε_0 – vacuum permittivity, ω – frequency, i – imaginary unit. The parameters of the aqueous phases of the DNA solution and the solvent calculated on the basis of the fitting were compared with each other to identify differences. Since the aqueous phase of the DNA solution differs from the aqueous phase of the solvent by the presence of hydration shells of DNA, information about these hydration shells can be extracted from comparing the values of their parameters. At the same time, all parameters have a certain physical meaning in terms of the intermolecular structure and dynamics of water, established in the theory of dielectric spectroscopy.

The described method was used to analyze DNA hydration in three solvents: water, aqueous solutions of 40mM MgCl_2 and 150mM KCl. Solutions of pET-11c plasmid DNA in the circular form with a concentration of 25 mg/ml were used. The circular form is preferable (compared to the supercoiled form), since it achieves the maximum contact area of the DNA surface with water, which maximizes the observed effects of hydration.

Statistically significant differences were found for all DNA solutions: a decrease in Δε_1, an increase in Δε_2 and A/ω_0^2 compared to the corresponding solvents. A decrease in Δε_1 indicates the presence of more strongly bound water molecules in the hydration shell. As is known, such molecules are located in the primary hydration shell of DNA, mainly on phosphates. An increase in Δε_2 indicates an increase in the number of free water molecules, apparently in the transition layer between primary hydration and undisturbed water. An increase in A/ω_0^2 in the absence of a change in ω_0 indicates the presence of a hydration region with an increased number of hydrogen bonds. This is most likely realized in the grooves of DNA, since a large number of hydrogen bonds with water molecules are formed there. As a result, it is concluded that there are three different DNA hydration regions with the specified features.

The presence of 40mM MgCl_2 in solution has almost no effect on hydration, whereas the presence of 150mM KCl significantly weakens it, judging by all the parameters discussed. These effects do not correlate with the ionic strength of solutions, so they are ion-specific. Mg^(2+) ions are known to bind strongly to DNA phosphate groups, which leads to a change in the charge sign of these groups from –1 to +1. Therefore, the effect of Mg^(2+) on DNA hydration essentially consists in changing the orientation of water molecules in the primary hydration layer of phosphates and should not affect the rest of the hydration shell in any way, which we see from the results obtained. For K^+ ions, on the contrary, DNA hasn’t strong binding sites, which means that they are distributed throughout the hydration shell. At the same time, K^+ is an ion with negative hydration, that is, it has a destructive effect on the water structure. This explains the observed weakening of DNA hydration in the KCl solution. The described effect of К^+ ions with intracellular concentration on DNA hydration may have a biological meaning: it may be one of the factors influencing the functioning of DNA through its hydration shell.



1.Principles of nucleic acid structure:By W.Saenger. Springer-Verlag,New York.1984.

2.N.Penkov,N.Penkova. Effective Medium Model Applied to Biopolymer Solutions. Appl. Spectrosc.(2021),75(12):1510-1515.