Изучение молекулярных основ процессов, происходящих в живой клетке в нормальных и неблагоприятных (стрессовых) условиях – одна из фундаментальных задач молекулярной и клеточной биологии. За последние десятилетия накопилось большое количество данных, свидетельствующих о существенной роли немембранных органелл в пространственной организации внутриклеточного пространства и регуляции сигнальных путей в ответе на стресс.

Как правило, немембранные органеллы представляют собой жидко-капельные образования, образующиеся в результате неспецифических мультивалентных взаимодействий между неупорядоченными участками РНК-связывающих белков и молекулами РНК. В ряде случаев жидко-капельные конденсаты биополимеров могут трансформироваться в гелеобразные агрегаты и даже более упорядоченные структуры, как патологические, так и функционально значимые. Примером нединамичных функционально значимых структур, образующихся в результате фазовых переходов биополимеров, являются А-тельца.

А-тельца возникают в ядрышке в ответ на стресс, вызванный изменением температуры, рН, осмотического давления и т.д. Они содержат в амилоидном состоянии сотни белков, ответственных за пролиферативную активность, транскрипцию и другие клеточные функции. Образование А-телец начинается с активации транскрипции с межгенных спейсеров рибосомальной ДНК (ribosomal intergenic spacers, rIGS) длинной некодирующей РНК (днРНК), которая называется rIGSRNA (ribosomal intergenic spacer RNA). rIGSRNA выступает в качестве структурного элемента и зародышообразователя А-телец. Дальнейшее созревание А-телец происходит за счет рекрутирования белков-партнеров rIGSRNA. Транскрипты rIGSRNA представляют собой отрицательно заряженные последовательности с низкой степенью сложности и состоят из тандемных повторов (CU)n/(AG)n. Увеличение концентрации этих молекул в окрестности геномных локусов rIGS ведет к образованию бимолекулярных конденсатов, к которым, за счет электростатических взаимодействий, привлекаются внутренне неупорядоченные и амилоидогенные белки, содержащие неупорядоченные положительно заряженные участки. Наличие гидрофобных АСМ (amyloid-converting motif)-мотивов в составе этих белков при условии их высокой концентрации в составе А-телец создает условия для трансформации конденсатов в гелеобразное состояние и, далее, в агрегаты амилоидных фибрилл. Этот этап завершает созревание А-телец. Окончание стрессового воздействия вызывает разборку А-телец с помощью шаперонной системы клетки и растворение амилоидных фибрилл. Таким образом, А-тельца обеспечивают хранение белков в стрессовых условиях в амилоидной форме без необходимости их деградации и синтеза de novo.

Известно, что образование патологических амилоидных фибрилл сопутствует ряду тяжелых, в том числе нейродегенеративных заболеваний. В связи с этим, представляется существенным изучение структуры, механизмов разборки функциональных фибрилл, а также причин перехода этих фибрилл в нерастворимое состояние.

Данная работа направлена на изучение механизмов образования и функциональной роли А-телец. Нами были разработаны подходы для визуализации А-телец. Сигналом к формированию А-телец является транскрипция днРНК rIGSRNA, с которой связывается убиквитилигаза VHL (von Hippel-Lindau protein). Для визуализации А-телец в исследуемых клетках были созданы плазмиды, кодирующие белки слияния флуоресцентного белка EGFP с изоформами VHL (VHL30 и VHL19). Далее полученные конструкты трансфецировали в клетки аденокарциномы человека MCF-7 и инкубировали в диапазоне температур от 40 до 43 градусов Цельсия для индуцирования клеточного теплового шока. Осмотический стресс был создан введением в клетки NaCl, а индукция стресс-ответа в исследуемых клетках вследствие изменения рН была осуществлена путем закисления сред для культивирования клеток и инкубации клеток в присутствии 1% кислорода.

Показано, что вне зависимости от типа стрессового воздействия, наблюдается увеличение ядерной локализации изоформ VHL в клетках MCF-7, подвергшихся стрессовому воздействию, а также формирование компартментов, окрашиваемых красителями, специфически взаимодействующих с амилоидными фибриллами. Это указывает на формирование А-телец. Динамичность образовавшихся в результате стрессового воздействия А-телец была исследована методом восстановления флуоресценции EGFP после ее фотообесцвечивания (FRAP). Установлено, что А-тельца, образовавшиеся в результате инкубации клеток в течение 1 часа при 43 градусах Цельсия, теряют свою динамичность.

Образование А-телец в клетках, подвергшихся стрессовому воздействию, было также исследовано с помощью электронной микроскопии. Для этих целей использовали ультратонкие срезы клеточной культуры, помещенные на никелевые сетки и дополнительно обработанные контрастирующим раствором. Показано, что тепловой стресс вызывает формирование в ядрышках исследуемых клеток аморфных и фибриллярных электронно-плотных структур.

Для визуализации целевого rIGSRNA транскрипта в фиксированных клетках был выполнен FISH. Установлено образование rIGS16RNA кластеров в ядрышках клеток MCF-7, подвергшихся тепловому стрессу.

Была исследована способность белка VHL образовывать фибриллярные структуры in vitro. Для этих целей препараты VHL инкубировали в растворах с нейтральным рН в присутствии высоких концентраций краудинг-агентов и в растворах с кислым рН. Установлено, что в растворах нейтральным рН молекулы VHL образуют аморфные агрегаты, в то время как в растворах с кислым рН – амилоидные фибриллы.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда грант РНФ № 21-75-10166 (руководитель Фонин А.В.).

The study of the molecular basis of processes occurring in a living cell under normal and unfavorable (stress) conditions is one of the fundamental tasks of molecular and cellular biology. Over the past decades, a large amount of data has accumulated that indicates a significant role of non-membrane organelles in the spatial organization of the intracellular space and the regulation of signaling pathways in response to stress.

As a rule, non-membrane organelles are liquid droplets formed as a result of nonspecific multivalent interactions between disordered regions of RNA-binding proteins and RNA molecules. In some cases, liquid-drop condensates of biopolymers can transform into gel-like aggregates and even more ordered structures, both pathological and functionally significant. A-bodies are an example of non-dynamic functionally significant structures formed as a result of phase transitions of biopolymers.

A-bodies arise in the nucleolus in response to stress caused by changes in temperature, pH, osmotic pressure, etc. They contain in the amyloid state hundreds of proteins responsible for proliferative activity, transcription, and other cellular functions. The formation of A-bodies begins with the activation of transcription from intergenic spacers of ribosomal DNA (ribosomal intergenic spacers, rIGS) of a long non-coding RNA (lncRNA) called rIGSRNA (ribosomal intergenic spacer RNA). rIGSRNA acts as a structural element and nucleator of A-bodies. Further maturation of A-bodies occurs due to the recruitment of rIGSRNA partner proteins. The rIGSRNA transcripts are negatively charged sequences with a low degree of complexity and consist of (CU)n/(AG)n tandem repeats. An increase in the concentration of these molecules in the vicinity of genomic rIGS loci leads to the formation of bimolecular condensates, to which, due to electrostatic interactions, internally disordered and amyloidogenic proteins containing disordered positively charged regions are recruited. The presence of hydrophobic ACM (amyloid-converting motif) motifs in these proteins, provided that they are highly concentrated in A-bodies, creates conditions for the transformation of condensates into a gel-like state and, further, into aggregates of amyloid fibrils. This stage completes the maturation of A-bodies. The end of stress exposure causes the disassembly of A-bodies with the help of the chaperone system of the cell and the dissolution of amyloid fibrils. Thus, A-bodies provide storage of proteins under stress conditions in the amyloid form without the need for their degradation and de novo synthesis.

It is known that the formation of pathological amyloid fibrils accompanies a number of severe diseases, including neurodegenerative diseases. In this regard, it seems essential to study the structure, mechanisms of disassembly of functional fibrils, as well as the reasons for the transition of these fibrils to an insoluble state.

This work is aimed at studying the mechanisms of formation and the functional role of A-bodies. We have developed approaches for the visualization of A-bodies. The signal for the formation of A-bodies is the transcription of lncRNA rIGSRNA, which binds to the ubiquitin-ligase VHL (von Hippel-Lindau protein). To visualize A-bodies in the studied cells, plasmids encoding fusion proteins of the fluorescent EGFP protein with VHL isoforms (VHL30 and VHL19) were created. Next, the obtained constructs were transfected into MCF-7 human adenocarcinoma cells and incubated in the temperature range from 40 to 43 degrees Celsius to induce cellular heat shock. Osmotic stress was created by introducing NaCl into the cells, and the induction of a stress response in the studied cells due to a change in pH was carried out by acidifying the cell culture media and incubating the cells in the presence of 1% oxygen.

It has been shown that, regardless of the type of stress, there is an increase in the nuclear localization of VHL isoforms in MCF-7 cells exposed to stress, as well as the formation of compartments stained with dyes specifically interacting with amyloid fibrils. This indicates the formation of A-bodies. The dynamism of A-bodies formed as a result of stress exposure was studied using the method of EGFP fluorescence recovery after its photobleaching (FRAP). It has been established that A-bodies formed as a result of the incubation of cells for 1 hour at 43 degrees Celsius lose their dynamism.

The formation of A-bodies in stressed cells was also examined using electron microscopy. For these purposes, ultrathin sections of the cell culture were used, placed on nickel grids and additionally treated with a contrast solution. It has been shown that heat stress causes the formation of amorphous and fibrillar electron-dense structures in the nucleoli of the studied cells.

FISH was performed to visualize the target rIGSRNA transcript in fixed cells. The formation of rIGS16RNA clusters in the nucleoli of MCF-7 cells exposed to heat stress was established.

The ability of the VHL protein to form fibrillar structures in vitro was investigated. For these purposes, VHL preparations were incubated in solutions with neutral pH in the presence of high concentrations of crowding agents and in solutions with acidic pH. It has been established that in solutions with neutral pH, VHL molecules form amorphous aggregates, while in solutions with acidic pH, they form amyloid fibrils.

The work was financially supported by the Russian Science Foundation (grant no. 21-75-10166) of the Russian Science Foundation (scientific supervisor Fonin A.V.).