В настоящее время всё большую актуальность приобретают исследования физико-химических свойств сверхвысоких разведений (СВР) различных веществ [1, 2]. СВР обладают способностью изменять физико-химические свойства ряда хорошо изученных модельных систем, то есть обладают модифицирующим действием [3]. Данное модифицирующее действие уже применяется как для регуляции молекулярно-биологических процессов, так и в материаловедении [4, 5].

Целью данной работы было изучение модифицирующего действия СВР гемоглобина, а также СВР люминола на хорошо известной модели люминол-зависимой хемилюминесценции гемоглобина в присутствии пероксида водорода.

В качестве экспериментальных образцов использовались СВР гемоглобина, СВР люминола, а в качестве технологического и интактного контролей были взяты СВР очищенной воды и очищенная вода, соответственно. Выполнение измерений технологического контроля было необходимо для того, чтобы учесть как возможные погрешности выполнения технологии, так и возможное влияние самой технологии последовательных разведений на свойства растворителя. Методика приготовления СВР представляла собой ряд последовательных стократных разбавлений, сопряженных с интенсивным механическим воздействием (встряхиванием). Для выполнения измерений, к смеси фосфатного буфера, гемоглобина, люминола и экспериментального образца или контроля, добавляли пероксид водорода, после чего происходило его взаимодействие с гемоглобином с образованием радикалов, приводящих к окислению люминола с последующей хемилюминесценцией. Конечные концентрации составляли: фосфатного буфера 4,92 мМ, гемоглобина 0,167 мкМ, люминола 83,3 мкМ, пероксида водорода 30 мкМ, а также по 150 мкл экспериментальных образцов или контролей. Конечный объем смеси составлял 300 мкл. Измерения проводились на хемилюминометре Lum-1200 (ДиСОФТ, Россия) при температуре 37 °С в течение 10 минут.

В результате эксперимента было установлено, что интенсивность хемилюминесценции через 3 минуты после добавления пероксида водорода в присутствии СВР люминола или СВР гемоглобина статистически значимо (p<0.05) уменьшилась на 12,4% и 21,8% соответственно по сравнению с образцом содержащим воду очищенную. Также есть статистически значимое отличие между образцами, содержащими: СВР очищенной воды и СВР гемоглобина, равное 17,55%; СВР гемоглобина и СВР люминола, равное 11,96%. При этом между образцами, содержащими воду очищенную и СВР очищенной воды, статистически значимых отличий нет. Абсолютные значения (в тысячах пульсов в секунду) образцов с: интактной очищенной водой 8,698±0,342; СВР очищенной воды 8,253±0,686; СВР люминола 7,620±0,259; СВР гемоглобина 6,805±0,150. Результаты описательной статистики представлены в формате Среднее±Стандартное отклонение. Межгрупповое сравнение выполнялось при помощи критерия Стьюдента.

Таким образом однозначно показано модифицирующее действие СВР гемоглобина и СВР люминола на модели люминол-зависимой хемилюминесценции смеси гемоглобина в присутствии пероксида водорода, что свидетельствует об изменении физико-химических свойств модельной системы.

Модифицирующее действие СВР может быть использовано как для создания новых, так и для контроля качества существующих лекарственных препаратов, для исследования экспериментальных моделей, имеющих большое медико-биологическое применение в понимании биофизических основ патофизиологических процессов, в материаловедении и других отраслях.



[1] Bunkin, N. F., Shkirin, A. V., Ninham, B. W., Chirikov, S. N., Chaikov, L. L., Penkov, N. V., ... & Gudkov, S. V. (2020). Shaking-induced aggregation and flotation in immunoglobulin dispersions: Differences between water and water–ethanol mixtures. ACS omega, 5(24), 14689-14701

[2] Shcherbakov, I. A. (2022). Current trends in the studies of aqueous solutions. Physics of Wave Phenomena, 30(3), 129-134

[3] Epstein O. I. et al. Membrane and synaptic effects of anti-S-100 are prevented by the same antibodies in low concentrations. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library. 8, 79-84. (2003)

[4] Novikov, V. V., Yablokova, E. V., & Fesenko, E. E. (2020). The role of water in the effect of weak combined magnetic fields on production of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils. Applied Sciences, 10(9), 3326.

[5] Spitsin, A. I., Bush, A. A., & Kamentsev, K. E. (2020). Piezoelectric and dielectric properties of Bi3TiNbO9 prepared by hot pressing from powders activated using the serial dilution method. Scientific Reports, 10(1), 1-13.

Currently, studies of the physical-chemical properties of ultrahigh dilutions (UHDs) of various substances are becoming increasingly relevant [1, 2]. UHDs are able to alter the physical-chemical properties of some well-studied model systems, that is, they have a modifying effect [3]. This modifying effect is already used both for the regulation of molecular biological processes and in materials science [4, 5].

The aim of this work was to study the modifying effect of UHD of hemoglobin and UHD of luminol in a well-known model of luminol-dependent chemiluminescence of hemoglobin in the presence of hydrogen peroxide.

The UHD of hemoglobin, the UHD of luminol were used as experimental samples, and the UHD of purified water and purified water were taken as technological and intact controls, respectively. It was necessary to perform measurements of technological control in order to take into account both possible errors in the implementation of the technology, and the possible influence of the technology of successive dilutions on the properties of the solvent. The UHD preparation method involved a series of successive centesimal dilutions combined with intensive mechanical treatment (shaking). To perform measurements, hydrogen peroxide was added to a mixture of phosphate buffer, hemoglobin, luminol, and an experimental sample or control, after which it interacted with hemoglobin to form radicals, leading to luminol oxidation followed by chemiluminescence. The final concentrations were: phosphate buffer 4.92 mM, hemoglobin 0.167 μM, luminol 83.3 μM, hydrogen peroxide 30 μM, and 150 μl of experimental samples or controls. The final volume of the mixture was 300 μl. The measurements were carried out using a chemiluminometer Lum-1200 (DiSOFT, Russia) at 37°C for 10 minutes.

As a result of the experiment, it was found that the intensity of chemiluminescence 3 minutes after the addition of hydrogen peroxide in the presence of UHD luminol or UHD hemoglobin decreased statistically significantly (p<0.05) by 12.4% and 21.8% respectively compared with the sample containing purified water. There is also a statistically significant difference between the samples containing: UHD of purified water and UHD of hemoglobin, equal to 17.55%; UHD of hemoglobin and UHD of luminol, equal to 11.96%. At the same time, there are no statistically significant differences between the samples containing purified water and UHD of purified water. Absolute values (in thousands of pulses per second) of samples with: intact purified water 8.698±0.342; UHD of purified water 8.253±0.686; UHD of luminol 7.620±0.259; UHD of hemoglobin 6.805±0.150. The results of descriptive statistics are presented in the format Mean±Standard Deviation. Intergroup comparison was performed using Student's t-test.

Thus, the modifying effect of UHD of hemoglobin and UHD of luminol has been clearly shown in the model of luminol-dependent chemiluminescence of a hemoglobin mixture in the presence of hydrogen peroxide, which indicates a change in the physical-chemical properties of the model system.

The modifying effect of UHDs can be used both for the development of new medicines and for the quality control of existing ones, for the study of experimental models with extensive biomedical applications in understanding the biophysical basis of pathophysiological processes, in materials science, and other fields.



[1] Bunkin, N. F., Shkirin, A. V., Ninham, B. W., Chirikov, S. N., Chaikov, L. L., Penkov, N. V., ... & Gudkov, S. V. (2020). Shaking-induced aggregation and flotation in immunoglobulin dispersions: Differences between water and water–ethanol mixtures. ACS omega, 5(24), 14689-14701

[2] Shcherbakov, I. A. (2022). Current trends in the studies of aqueous solutions. Physics of Wave Phenomena, 30(3), 129-134

[3] Epstein O. I. et al. Membrane and synaptic effects of anti-S-100 are prevented by the same antibodies in low concentrations. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library. 8, 79-84. (2003)

[4] Novikov, V. V., Yablokova, E. V., & Fesenko, E. E. (2020). The role of water in the effect of weak combined magnetic fields on production of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils. Applied Sciences, 10(9), 3326.

[5] Spitsin, A. I., Bush, A. A., & Kamentsev, K. E. (2020). Piezoelectric and dielectric properties of Bi3TiNbO9 prepared by hot pressing from powders activated using the serial dilution method. Scientific Reports, 10(1), 1-13.