Одной из главных экологических проблем является повсеместное распространение микропластика. Тогда как большинство сред обитания уже загрязнены микрочастицами пластика, точные механизмы, участвующие в их клеточном поглощении и последующей токсичности, остаются не до конца исследованными [1]. Несмотря на распространенность в природе микропластмассы с нерегулярным размером и морфологией, важным материалом в изучении токсичности микропластика, за счет своей контролируемой формы, монодисперсности и коммерческой доступности, остаются частицы полистирола. Они широко используются для установления общего клеточного и молекулярного воздействия полимерных частиц [2]. Усиленная темнопольная микроскопия, дополненная гиперспектральной визуализацией (УТМ-ГВ) активно применяется в нанотехнологических исследованиях для обнаружения и идентификации различных наноматериалов в клетках и организмах. В данной работе исследован потенциал УТМ-ГВ для быстрого и точного обнаружения поглощения микропластика различного диаметра в первичной клеточной культуре [3].

Жизнеспособность фибробластов кожи человека после 24-часовой инкубации с полистиролом в диаметре 100–1000 нм была измерена с помощью колориметрического МТТ-теста. Морфология микрочастиц и их поглощение клетками после ко-инкубации исследовались с помощью системы усиленной темнопольной микроскопии CytoViva. Гиперспектральные снимки частиц и образцов клеток в диапазоне длин волн 400–1000 нм были получены для диагностики полистирола в растворе и клетках посредством алгоритма спектрального углового картирования. С целью оптимизации метода для высокопроизводительного анализа, собранные снимки визуализации микропластика разного размера были использованы в качестве набора данных для обучения нейронной сети. Полученная модель была протестирована на классификации образцов живых клеток для оценки возможности исследования поглощения микропластика в динамике.

Результаты показали, что образцы полистирола в концентрации до 5 мкг/мл не оказывали значимого воздействия на жизнеспособность клеток. Активность клеток несколько снижалась при воздействии частиц размером 200 и 1000 нм в концентрации 10 мкг/мл, в то время как воздействие частиц размером 100 нм стимулировало их жизнеспособность. Визуализация показала, что частицы микропластика присутствовали как внутри, так и снаружи клеточной мембраны, но не в ядрах клеток. Гиперспектральный анализ позволил классифицировать частицы разных размеров на основе их спектральных характеристик. При этом небольшая часть была классифицирована ошибочно, что вызвано идентичным химическим составом образцов. Внедрение нейронной сети в процесс анализа микропластика позволило сохранить высокую точность обнаружения при увеличении скорости обработки данных. Дальнейшие исследования с использованием этой методики могут углубить понимание воздействия микропластика на здоровье человека и окружающую среду.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 21-73-00097).



Список литературы:

1. Kögel T., Bjorøy Ø., Toto B., Bienfait A.M., Sanden M. Micro- and nanoplastic toxicity on aquatic life: Determining factors // Sci. Total Environ. 2020. Vol. 709. P. 136050.

2. Kooi M., Primpke S., Mintenig S.M., Lorenz C., Gerdts G., Koelmans A.A. Characterizing the multidimensionality of microplastics across environmental compartments // Water Res. 2021. Vol. 202. P. 117429.

3. Akhatova F., Ishmukhametov I., Fakhrullina G., Fakhrullin R. Nanomechanical Atomic Force Microscopy to Probe Cellular Microplastics Uptake and Distribution // Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23, № 2. P. 806.

The ubiquity of microplastics is one of the major environmental issues. Even though most habitats are already contaminated with microplastic, the aspects involved in their cellular uptake and response remain incompletely disclosed [1]. One of the valuable resources in studying microplastic toxicity is polystyrene microbeads due to their consistency and ease of access. Despite the prevalence in nature of secondary microplastic with irregular size and morphology, polystyrene microspheres are widely used for general establishing the cellular and molecular effects of microbeads [2]. Optical microscopy techniques, such as enhanced dark-field microscopy amended with hyperspectral imaging (EDFM-HSI), have found many applications in nanotechnology research, including the detection and identification of various nanomaterials in cells and organisms. The present study shows the potential of EDFM-HSI for the rapid and accurate uptake detection of microplastics of various diameters in primary cell culture [3].

The viability of human skin fibroblasts after the 24-h incubation with polystyrene with a diameter of 100-1000 nm was measured using a colourimetric MTT-assay. The morphology of microparticles and their cellular uptake after co-incubation were investigated using CytoViva's enhanced dark-field microscopy system. Hyperspectral images of pristine particles and cell samples in the 400-1000 nm wavelength range were captured to verify microbeads in solution and cells using the spectral angle mapper algorithm. To optimize the method for high-throughput analysis, the collected imaging data from differently sized microplastic were used as a dataset for the neural network training. The obtained model was then tested on the classification of living cell samples to assess the possibility of dynamic cellular uptake analysis.

The results showed that polystyrene samples at concentrations up to 5 µg/mL did not have a significant impact on cell viability. However, at 10 µg/mL, the viability of cells slightly decreased when exposed to 200 and 1000 nm particles, while exposure to 100 nm particles stimulated cell viability. Imaging revealed that microplastic particles were present both inside and outside the cell membrane, but not within the cell nuclei. The hyperspectral analysis allowed us to classify particles of different sizes based on their reflectance with a small portion of misclassified objects, which was caused by their identical chemical composition. Involving the neural network in the process of microplastic analysis made it possible to maintain high detection accuracy with the increased data processing rate. Further research using this technique may give insights into the process of microplastic uptake and improve the understanding of its impacts on human health and the environment.

The study was funded by the Russian Science Foundation grant 21–73-00097.



References:

1. Kögel T., Bjorøy Ø., Toto B., Bienfait A.M., Sanden M. Micro- and nanoplastic toxicity on aquatic life: Determining factors // Sci. Total Environ. 2020. Vol. 709. P. 136050.

2. Kooi M., Primpke S., Mintenig S.M., Lorenz C., Gerdts G., Koelmans A.A. Characterizing the multidimensionality of microplastics across environmental compartments // Water Res. 2021. Vol. 202. P. 117429.

3. Akhatova F., Ishmukhametov I., Fakhrullina G., Fakhrullin R. Nanomechanical Atomic Force Microscopy to Probe Cellular Microplastics Uptake and Distribution // Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23, № 2. P. 806.